Staminali emopoietiche homemade: ci siamo quasi!

Gli Autori derivano cellule dell’endotelio emogenico da hPSC e attraverso l’utilizzo di citochine ematopoietiche sono in grado di assistere alla transizione endotelio-emopoietica (EHT) con la comparsa di cellule CD34+CD45+ (markers tipici delle HSC). Dal punto di vista del profilo di espressione genica, queste cellule presentano una down-regolazione di geni tipici delle cellule endoteliali ed una concomitante up-regolazione di geni tipici delle HSC. Tuttavia, il trapianto di queste cellule nell’animale non è in grado di generare emopoiesi.

Per tale motivo, gli Autori decidono di inserire dei fattori di trascrizione tipici delle HSC nelle EHT con lo scopo di riprogrammarle e renderle in grado di engraftare l’animale. Per tale motivo, gli Autori selezionano 26 fattori di trascrizione tipici delle HSC, che vengono clonati in altrettanti vettori virali sotto un promotore doxiciclina-inducibile. Le EHT sono quindi trasdotte con i suddetti vettori virali con lo scopo di identificare quali fattori di trascrizione siano in grado di migliorare l’engraftment. Per far ciò, le EHT trasdotte vengono iniettate nell’animale in concomitanza con la somministrazione di doxiciclina, al fine di attivare l’espressione del transgene. Su 11 topi trattati, 5 dimostrano un engraftment stabile multilineare, con ricostituzione della linea mieloide, linfoide ed eritroide.

Gli Autori analizzando quindi i topi che hanno mostrato engraftment ed identificano 7 fattori di trascrizione: ERG, HOXA5, HOXA9, HOXA10, LCOR, RUNX1, SPI1. Per conferma, vengono generate EHT trasdotte con tutti e 7 i fattori di trascrizione (chiamate HE-7TF) che, una volta iniettate, dimostrano di essere in grado di generare un’emopoiesi stabile e multilineare. Attraverso un approccio combinatoriale, gli Autori, attraverso successivi trapianti nell’animale, determinano che ERG, HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1 sono fattori indispensabili per ottenere engraftment.

Globalmente, su 13 topi trattati con le HE-7TF, 5 presentano un emopoiesi multilineare stabile, mentre i restanti 8 sviluppano la linea linfoide ed una sola tra la linea eritroide e mieloide. Al fine di dimostrare la staminalità di queste cellule, gli Autori decidono di trapiantare il midollo dei 5 topi con emopoiesi completa in altrettanti topi riceventi, ottenendo un’emopoiesi multilineare stabile e completa.

Successivamente lo stesso esperimento viene ripetuto utilizzando le EHT trasdotte con i 5 fattori di trascrizione identificati come indispensabili (ERG, HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1). Anche in questo caso, i topi trattati dimostrano un’emopoiesi stabile multilineare. Inoltre, il midollo di questi topi si dimostra in grado di engraftare animali riceventi.

L’analisi dell’espressione genica delle HE-7TF evidenzia come queste cellule abbiano un profilo simile all’endotelio emogenico, alle HSC del cordone ombelicale trapiantato e alle CD34+ isolate a fresco dal cordone. Inoltre, sebbene il profilo genico evidenzi una somiglianza incompleta con le HSC, i geni essenziali per il mantenimento delle HSC risultano espressi in maniera simile.

Infine, gli Autori esaminano il profilo e la funzionalità delle cellule mature derivate da topi trapiantati con HE-7TF: per quanto riguarda la linea eritroide, linfoide e mieloide non si rilevano significative differenze con le cellule mature derivate da topi controllo trapiantati con HSC da cordone ombelicale umano. Questo dato dimostra come le cellule emopoietiche derivate dalle HE-7TF risultino essere normali a dimostrazione di una normale maturazione dei progenitori di tutte e tre le linee emopoietiche.