Beta talassemia: nuove prospettive
In questo lavoro, gli Autori sfruttano le moderne tecnologie di genome editing per generare un metodo alternativo di trattamento dei pazienti beta-talssemici.
La beta-talassemia rappresenta una delle più frequenti cause di anemia congenita. Al fine di trattare questa condizione, numerosi approcci terapeutici sono stati utilizzati. Al momento, il gold standard è costituito da una terapia di supporto con emazie concentrate, ferro-chelazione ed eventuale trapianto di midollo osseo. Inoltre, diversi farmaci possono essere utilizzati per aumentare la sintesi della catena globinica gamma al fine di compensare la riduzione/assenza di catena beta. In anni recenti, con l’avvento della terapia genica e delle moderne tecniche di genome editing, nuovi approcci sono stati tentati. Di particolare importanza e risonanza è la rivoluzione portata dalle CRISPR-Cas9. Queste nucleasi, oltre a tagliare il genoma, permettono di effettuare una riparazione del DNA mirata, correggendo il difetto genico. Questo approccio è stato utilizzato anche nell’ambito della beta-talassemia, sebbene con un’efficienza bassa.
Il mispairing tra catena alfa e beta è uno dei problemi fondamentali alla base della patogenesi della beta-talassemia. Ormai è noto in letteratura che il numero di geni alfa presenti in un soggetto beta-talassemico influenzi il fenotipo: la co-presenza di un difetto sia alfa che beta globinico genera un quadro di malattia più lieve. In rari pazienti beta-talassemici con un fenotipo più lieve, sono state identificate alcune mutazioni a livello dei promotori della catena alfa (in particolare a livello di MCS-R2). Studi condotti su modelli murini hanno confermato come la delezione della regione MCS-R2 a livello delle cellule staminali sia in grado di ridurre in maniera significativa la produzione di catena alfa, senza tuttavia abrogarla del tutto.
In considerazione di questi dati, Mettananda et al. ipotizzano che una delezione a livello di MCS-R2, generata attraverso l’uso di CRISPR-Cas9, possa portare ad una riduzione dei livelli di catena alfa con conseguente miglioramento del quadro clinico in pazienti con beta-talassemia.
Gli Autori partono dall’osservazione di un paziente beta-talassemico con una concomitante delezione a livello di MCS-R2 in omozigosi e conseguente riduzione ma non abrogazione della produzione di catene alfa. Tale osservazione conferma gli studi già presenti in letteratura, effettuati in un modello murino con knock-down di MCS-R2 in cui la produzione alfa globinica è ridotta sia negli animali eterozigoti che in quelli omozigoti.
Al fine di generare una delezione in vitro della regione MCS-R2 in cellule staminali emopoietiche (HCS) umane sane con CRISPR-Cas9, gli Autori testano una serie di guide RNA. Le guide sono inserite all’interno di un vettore plasmidico insieme alla Cas9, quest’ultima coniugata ad una proteina fluorescente che consente l’identificazione e la selezione delle cellule editate al citofluorimetro. Tra le diverse guide valutate, 4 dimostrano di avere un’efficienza nell’indurre delezioni superiore al 70%. Dal punto di vista funzionale, i globuli rossi derivati dalle HSC modificate presentano una riduzione quantitativa della catena alfa con conseguente rapporto tra catena alfa e beta ridotto.
Al fine di valutare se l’editing delle cellule CD34+ coinvolge unicamente cellule progenitrici o anche elementi staminali più immaturi, gli Autori decidono di iniettare le HSC umane editate in un modello murino di TMO. In questo contesto, si assiste a una completa ricostituzione ematologica ed alla comparsa di cellule ematiche di origine umana. L’analisi genomica di questi ultimi elementi rivela la presenza di una delezione a livello della regione MCS-R2. Questo esperimento conferma come la delezione di MCS-R2 sia in grado di ridurre la produzione alfa globinica senza tuttavia impattare sulla normale funzionalità della cellula staminale.
Infine, gli Autori utilizzano le CRISPR-Cas9 per indurre la delezione di MCS-R2 in HSC derivate da pazienti beta-talassemici. L’editing genomico si dimostra in grado di ridurre la produzione di catena alfa e conseguentemente di ridurre il rapporto tra catena alfa e beta, talvolta normalizzandolo completamente. Questo esperimento dimostra il potenziale utilizzo di CRISPR-Cas9 per il trattamento della beta-talassemia.
Negli ultimi anni, sempre più studi sono stati pubblicati sul trattamento della beta-talassemia mediante l’utilizzo del genome editing. Nella maggior parte dei lavori pubblicati in cui sono state impiegate le CRISPR-Cas9, è stata tentata una riparazione del gene attraverso l’introduzione di uno stampo di DNA “sano” al fine di correggere la mutazione presente. Tuttavia, l’efficienza di questa tipologia di approcci è ancora bassa. Questo studio effettuato da Mettananda et al. è il primo in cui si utilizzano le CRISPR-Cas9 per introdurre una delezione e una conseguente perdita di funzione a livello del promotore principale della catena alfa. In questa maniera, gli Autori ottengono una riduzione ma non una completa abolizione dei livelli di alfa globina, migliorando il rapporto tra la catena alfa e la beta.
Sebbene richieda ulteriori conferme, questo studio introduce una nuova possibilità terapeutica per il trattamento della beta-talassemia attraverso le moderne tecniche di genome editing.
Post realizzato in collaborazione con il dott. Matteo Doglio
Mettananda S. - Editing an α-globin enhancer in primary human hematopoietic stem cells as a treatment for β-thalassemia. Nature Communications 8, Article number: 424(2017)
